Spinning off fra de populære professor Layton puslespil, denne film bringer Layton og hans trofaste assistent Luke til den store skærm for at tillade fans at nyde mere af det samme. I begyndelsen af filmen modtager Layton et brev fra den berømte operasanger, Jenice Kaitly, invitere dem til at se hende nyeste præstation. Hun spørger også Layton, Luke, og Remi om hjælp i et mysterium, siger veninden Melina forsvandt for et år siden, men vendte tilbage senere som en syv-årig pige siger hun havde fundet hemmeligheden om evigt liv. Naturligvis sagen fascinerer Layton og hans lærlinge, så de leder til Crown Petone operahus. Når de ankommer, er der noget meget mærkeligt: pianisten, Ozro Vislar taler om et spil, og vinderen vil vinde "evigt liv." Det er op til Layton, Luke, og Remi at løse mysteriet om den evige Diva før det er for sent.